In Life-Sciences, der chemisch-pharmazeutischen Analytik oder auch in den modernen Materialwissenschaften reichen oft klassische mikroskopische Verfahren hinsichtlich optischer Auflösung oder Informationsgehalt nicht mehr aus. Daher kann es sinnvoll sein, unterschiedliche Methoden miteinander zu kombinieren. Modular aufgebaute, hochauflösende Mikroskopsysteme sind hier prädestiniert. Jedoch benötigen sie auch eine hochgenaue und dynamische Probenpositioniermöglichkeit. Dafür sorgen piezobasierte Scantische, die sich dank ihrer kompakten Bauweise gut in die Mikroskope integrieren lassen.

Der Mensch dringt immer tiefer in die filigranen Strukturen der Materie ein, um sie sichtbar zu machen und zu analysieren. Hierzu braucht er entsprechende Instrumente wie hochgenaue Mikroskope und Probenpositioniersysteme. Die höchstauflösenden Mikroskopiesysteme von Witec sind modular aufgebaut (Abb. 1). Dadurch ist es beispielsweise möglich, ein konfokales Ramanmikroskop bei Bedarf mit Rasterkraft-Mikroskopie zu kombinieren (AFM). Das gleiche Gerät kann dann molekulare Raman- und strukturelle AFM-Informationen derselben Probenregion liefern und in Zusammenhang bringen. Für hochauflösende optische Informationen lässt sich das Mikroskop auch zusätzlich noch mit Nahfeldmikroskopie (Scanning Near Field Optical Microscopy, SNOM) ausstatten. Dadurch sind, ganz nach Bedarf der jeweiligen Anwendung, präzise optische, topografische und molekulare Analysen möglich, von denen die unterschiedlichsten Anwendungsbereiche profitieren. Das Einsatzspektrum der modular aufgebauten Hochpräzisionsmikroskope reicht von der pharmazeutischen Forschung und Lebendzellen-Untersuchungen über Nanophotonik, Forensik bis hin zu Analysen in Photovoltaik- oder Halbleitertechnik.
Nahaufnahmen unterhalb der Beugungsgrenze
Die optische Nahfeldmikroskopie erlaubt die Abbildung von wesentlich kleineren Strukturen, als es mit der konventionellen Mikroskoptechnik möglich ist (Abb. 2). Denn bei Letzteren ist die Auflösung durch Beugungseffekte am Objektiv auf rund die Hälfte ihrer Strahlungswellenlänge begrenzt. Anders bei SNOM: Hier koppelt eine Glasfaser Laserlicht in eine Messspitze, die innen hohl ist. Das Licht tritt an der Spitze durch eine winzige Öffnung aus, die einen Durchmesser von weniger als 100 nm hat. Wird die Öffnung der Messspitze in geringen Abstand zur Probenoberfläche gebracht, lässt sich so ein Spot deutlich unterhalb der Beugungsgrenze klassischer Mikroskopie beleuchten. Bis zu ca. 60 nm laterale Auflösung sind erzielbar, während der Wert bei konfokaler (Licht)Mikroskopie üblicherweise zwischen etwa 200 bis 300 nm liegt.
Die Probe wird dann Punkt für Punkt gerastert. Dazu wird sie unter der Messspitze von einem piezogetriebenen, hochauflösenden Scantisch verfahren. An jeder Position nimmt die im Mikroskop integrierte Kamera die ankommende Lichtintensität auf und speichert diesen Wert zusammen mit der Positionsinformation. Daraus wird dann das Bild zusammengesetzt. Auflösung und Genauigkeit des Bildes sind also auch erheblich von der Positioniergenauigkeit und -Stabilität des Scantisches abhängig.

Informationen über die Oberflächentopologie

SNOM liefert gleichzeitig auch Informationen zur Oberflächentopologie: Da der Abstand zwischen Messspitze und Oberfläche konstant gehalten werden muss und praktisch keine Oberfläche wirklich eben ist, muss die Probenposition in z-Richtung nachgeregelt werden. Diese Aufgabe übernimmt ebenfalls der Scantisch. Dieses Nachregeln der z-Position liefert topologische Informationen zusätzlich zum optischen SNOM-Bild. Die z-Auflösung der Topografieinformationen ist ungefähr mit AFM vergleichbar. Die laterale Auflösung liegt bei ca. 100 nm.
Auch beim AFM-Verfahren wird die Messspitze zeilenweise in einem definierten Raster über die Probenoberfläche geführt. Gemessen werden Kräfte zwischen einer sehr dünnen Messspitze und der Objektoberfläche, die dann Aufschluss über die Topografie der Oberfläche geben. Zudem können Probeneigenschaften wie Adhäsion, Steifigkeit oder Viskosität bestimmt werden. Das laterale Auflösungsvermögen liegt bei 10 nm und darunter. Auch hier wird die Position der Probe in Richtung der z-Achse nachgeregelt. Die Variation der z-Position zusammen mit den für die Ortsauflösung relevanten x- und y-Koordinaten liefern dann die hochpräzisen Topografie-Informationen der Proben (Abb. 3).

Der chemische Fingerabdruck

Die Ramanmikroskopie basiert auf einem konfokalen, optischen Mikroskop, kombiniert mit einem Ramanspektrometer. Bei einem konfokalen System werden Blenden verwendet, um Licht außerhalb der Fokusebene des Mikroskops zu unterdrücken. Somit erhält man nur Licht-Information aus der Fokusebene, die zum Spektrometer weitergeleitet wird. Im Spektrometer wird dieses Licht spektral aufgetrennt und detektiert. Die Probe wird Punkt für Punkt und Linie für Linie gescannt. Die laterale Auflösung liegt bei grünem Anregungslicht bei ca. 200 nm. Bei der Messung wird für jeden Bildpunkt ein komplettes Ramanspektrum aufgenommen. Diese Ramanspektren sind für jede Molekülart wie ein spezifischer Fingerabdruck, sodass die chemischen Bestandteile einer Probe für jeden Bildpunkt identifiziert und deren Verteilung in der Probe dargestellt werden können (Abb. 4).
Kombiniert man das Raman Imaging mit AFM hat man sowohl hoch aufgelöste topografische als auch molekulare Informationen über die Probenoberfläche. Da die entsprechenden Bilder nacheinander aufgenommen und dann überlagert werden (Abb. 5), sind die Anforderungen an den Scantisch extrem hoch. Schließlich ist die präzise Positionierung in allen drei Achsen Voraussetzung für die Genauigkeit des Bildes.

Positionieren mit höchster Auflösung und Dynamik

Die Auflösung muss im Sub-Nanometerbereich liegen, da das beim Scannen eingesetzte Positioniersystem die Ortsauflösung liefert. Gleichzeitig sind die Anforderungen an die Dynamik hoch, denn je schneller die Topographienachführung in z-Richtung erfolgt, desto schneller ist auch die Positionierung in x- und y-Achse möglich. Das verkürzt nicht nur die Messdauer, sondern reduziert auch eventuell vorhandene Temperatur-Drift, die sich zeitabhängig vergrößert. Eine hohe Dynamik kommt damit auch der Genauigkeit zugute.
Bei der Positionierung entschied sich Witec deshalb für einen piezobasierten Scantisch (Abb. 6) von Physik Instrumente. Er ist ausgelegt für Verfahrwege von 100 oder 200 µm in den Achsen der Scanebene und 30 µm in Richtung der z-Achse, ermöglicht eine Positionsauflösung besser als 2 nm und bietet damit beim Einsatz in den modular aufgebauten Mikroskopen für alle drei genannten Verfahren beste Voraussetzungen. Diese sehr hohe Bewegungsauflösung ist nur möglich, weil es bei der Bewegung der Piezoantriebe keine klassischen mechanischen Komponenten gibt, die Reibung oder mechanisches Spiel besitzen.

Kapazitive Sensoren und Digitalelektronik sorgen für Stabilität

Die Stabilität bzw. Bahngenauigkeiten während des Scans ist vor allem beim Raman Imaging in Kombination mit AFM wichtig, da die Messungen hier durchaus einige Minuten dauern und auftretende Drift die Aufnahmen verzerren würden. Zusätzlich erhöht die aktive Führung mit Hilfe kapazitiver Sensoren die Bahntreue: Die Sensoren messen eventuelle Abweichungen in der zur Bewegungsrichtung senkrechten Achse. Ein ungewolltes Übersprechen der Bewegung, z.B. durch externe Krafteinwirkung oder mechanisches Übersprechen in eine andere Achse kann so detektiert und in Echtzeit aktiv ausgeregelt werden.
Die dafür notwendige Steuerung übernimmt ein digitaler Controller. Er ist speziell auf den piezobasierten Scantisch abgestimmt und garantiert auch im dynamischen Betrieb eine gute Linearität. Die Digitalelektronik arbeitet außerdem mit hoher Taktrate, denn sie ist entscheidend für die genaue Zuordnung der Positionswerte des Scanners und der Aufnahmekamera. Wäre sie zu langsam oder ungenau, gäbe es bei der Zuordnung Auflösungsverluste und Verzerrungen (Jitter). Das piezobasierte Scansystem übernimmt damit eine wesentliche Rolle in den Hochpräzisionsmikroskopen und lässt sich dank seiner kompakten Abmessungen gut integrieren.